针对血液或体液中肿瘤细胞释放DNA片段的液体活检技术，凭借其无创性、敏感性、动态性等特质，可实现肿瘤早期筛查及伴随诊断。然而，由于游离核酸含量低和易降解，因此在复杂背景基因中来特异性富集和检测肿瘤基因得到广泛关注。常用的PCR等方法具有简单、省时等优点，但其检测灵敏度有限；近年来，基因编辑工具酶CRISPR/Cas在核酸检测中的应用，提升了检测灵敏度和便捷性，但Cas酶对靶标序列PAM选择性、长链guide RNA合成昂贵且不稳定等问题，导致检测成本、灵敏度、多重性等方面仍存在局限性。因此，研发能特异性富集靶标序列的新型核酸酶是解决上述难题的有效途径，建立高灵敏度、多重和简便的新型核酸检测技术对于基础研究和临床应用都具有重要意义。
2021年4月27日，在线发表了上海交通大学生命科学技术学院冯雁教授团队在Nucleic Acids Research发表了文章Argonaute integrated single-tube PCR system enables supersensitive detection of rare mutations。研究人员提出了一种新型“A-Star” 低丰度SNV核酸富集技术，通过发现Argonaute核酸酶对单碱基突变（SNV）靶标序列精准识别的规律，发展了“一管式”PCR多重核酸富集和检测的A-Star (Ago-Directed Specific Target Enrichment and Detection) 新策略，实现血液等样本中低丰度突变基因的高效、多重富集和检测。
在这项研究中，研究人员开发的低丰度SNV核酸富集技术整合了高温Argonaute蛋白的多个优良特性，包括高温稳定性、可编程性、对任意靶标核酸的精准剪切、特异性识别SNV靶标核酸、多重正交反应检测多重靶标。具体来说，研究人员首先通过对嗜热菌Argonaute酶学特性研究，筛选高温稳定及高效核酸酶活性的Argonaute蛋白，得到可与PCR扩增反应兼容的核酸酶PfAgo（Pyrococcus furiosus Argonaute）。接着揭示了PfAgo在DNA引导链介导下的精准剪切特性，巧妙的通过引导链错配设计，实现了对靶标核酸的单碱基区分，并建立了PfAgo-PCR偶联体系。该“一管式”反应体系可以实现PfAgo在PCR变性步骤（94 ℃）选择性剪切野生型基因，保留的突变基因可在PCR退火（～58 ℃）、延伸（～72 ℃）步骤中得以循环扩增，实现低丰度突变基因的超高效率富集和精准检测。富集样品可兼容Sanger测序、qPCR等多终端检测。
图1. “A-Star”低丰度 SNV富集和检测工作原理
研究人员测试了A-Star对KRAS、PIK3CA和EGFR等多个肿瘤突变基因的富集效果，证实A-Star能够轻松检测和定量0.01%的稀有突变，富集效率高达5,500倍。
图2 “A-Star”对不同丰度SNVs的富集效果（A）及定量分析（B）
对血液和实体瘤组织等复杂样品进行测试，证实A-Star可以高特异性和敏感性检测高背景DNA临床样本。
图3 “A-Star”用于临床样品的富集和检测
此外，考虑到实际样本中可能存在多种基因突变，A-Star通过设计多对引导链，在单酶“一管式”反应体系中，可实现同时检测多个肿瘤基因，且信号之间无交叉干扰。
图4. “A-Star”用于多重肿瘤基因突变的富集和检测
总的来说，A-Star低丰度SNV核酸富集技术具有高灵敏度、简便快捷及多重检测等优势。目前发展的常规检测方法，扩增阻滞突变技术很难检测到低于1％的SNV突变，而二代测序虽然灵敏度可以达到0.1%，但费用高、耗时长。基于可编程性核酸酶CRISPR/Cas的方法，对靶标序列依赖度高，多重检测体系复杂，RNA引导链合成成本也相对较高。这项基于Argonaute的A-Star技术，可针对任意靶标SNV序列，短链DNA引导链的设计简便经济，而且单酶就能实现多重检测，在基因诊断及遗传疾病治疗等分子生物学和医学领域具有更大应用潜力。
表1. 常见稀有基因突变富集检测方法比较
上海交通大学副研究员刘倩和博士生郭翔为该论文共同第一作者，冯雁教授为通讯作者。此研究得到了上海交通大学附属第一医院王红霞教授、仁济医院张风春教授、人和未来生物科技李凯教授的大力支持。相关技术已申报PCT专利，建立了具有我国自主知识产权的新型诊断技术，将进一步加强与附属医院、诊断公司合作，旨在有效推动肿瘤早筛相关领域的转化和推广。
冯雁教授简介
冯雁教授，1986年于吉林大学分子生物学系获学士学位，1989年于吉林大学酶工程国家重点实验室获硕士学位，1994年于白求恩医科大学获医学博士学位。1989-2008年在吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室任教，历任讲师、副教授、教授、重点实验室主任；期间，1994-1996年及1998-2000年先后在日本国立生命科学和技术研究所(NIBH)从事博士后和特别研究员工作；2003年在美国国立健康总署癌症研究所(NCI)开展高访学者研究。2009年至今，任上海交通大学特聘教授，博士生导师，973计划及国家重点研发计划项目首席科学家，生命科学院常务副院长。
冯雁教授主要从事微生物酶结构与机制研究、新功能酶分子设计与进化、微生物药物合成生物学等方面的研究。目前担任中国生物化学与分子生物学会常务理事、中国生物化学与分子生物学学会酶学专业委员会主任、中国微生物学会酶工程专业委员会委员；Molecular Catalysis、中国生物化学与生物物理学报等刊物编委；获得教育部“新世纪优秀人才支持计划”、“杜邦杰能科中国酶工程杰出贡献奖”、“上海市三八红旗手”等荣誉称号。
